蛋白芯片


蛋白芯片是一种高通量监测系统,通过靶分子和捕捉分子相互作用来监测蛋白分子之间的相互作用。捕获分子一般都预固定在芯片表面,由于抗体的高度特异性和与抗原强结合特性所以被广泛的用做捕获分子。对于研究蛋白芯片的研究在芯片表面有效固定抗体是非常关键的,特别是在固定抗体一致性方面非常关键对于增强蛋白芯片的灵敏度。G蛋白是一种抗体结合蛋白,他特意结合抗体FC片段,因此已被广泛的用于固定不同类型的抗体。

蛋白芯片 - 概述

蛋白芯片是一种高通量监测系统,通过靶分子和捕捉分子相互作用来监测蛋白分子之间的相互作用。捕获分子一般都预固定在芯片表面,由于抗体的高度特异性和与抗原强结合特性所以被广泛的用做捕获分子。对于研究蛋白芯片的研究在芯片表面有效固定抗体是非常关键的,特别是在固定抗体一致性方面非常关键对于增强蛋白芯片的灵敏度。G蛋白是一种抗体结合蛋白,他特意结合抗体FC片段,因此已被广泛的用于固定不同类型的抗体。C3-G蛋白N末端有三个半胱氨酸残基,这就使得为G蛋白做金标和薄膜提供了方便而不要化学修饰。用百特仑LINKER LP(LP-001)可以给GST-G蛋白做良好的导向G蛋白薄膜,这些导向G蛋白薄膜可以使得蛋白芯片具有更好的结合抗原的能力。

蛋白芯片 - 主要形式

是以蛋白质代替DNA作为检测对象,与在mRNA水平上的检测基因表达的基因芯片不同,它直接在蛋白水平上检测表达模式,在基因表达研究中基因芯片有着更加直接的应用前景。

蛋白阵列(protein arrays)主要有两种形式:一种是抗体阵列(antibody arrays),利用阵列上的抗体识别样品中的蛋白或其他分子;另一种则是我们今天要谈到的靶蛋白阵列(target protein arrays),通过阵列上的蛋白检测这些我们感兴趣的蛋白和其他分子,如药物、抗体、核酸、脂类或其他蛋白的作用。由于有高通量的优点,蛋白阵列是研究蛋白功能的好工具。

蛋白芯片 - 基本原理

它的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片,然后,用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用,与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合,抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表达数量。在将未与芯片上的蛋白质互补结合的抗体洗去之后利用荧光扫描仪或激光共聚扫描技术,测定芯片上各点的荧光强度,通过荧光强度分析蛋白质与蛋白之间相互作用的关系,由此达到测定各种基因表达功能的目的。为了实现这个目的,首先必须通过一定的方法将蛋白质固定于合适的载体上,同时能够维持蛋白质天然构象,也就是必须防止其变性以维持其原有的特定生物的活性。

另外,由于生物细胞中蛋白质的多样性和功能的复杂性,开发和建立具有多功能样品处理能力、能够进行快速分析的高通量蛋白芯片技术将有利于简化和加快蛋白质功能研究的进展。

蛋白芯片 - 液相蛋白芯片

在功能基因组时代,为了揭示生命活动的规律,蛋白质研究是必然的发展方向面对动态的多因素的生命活动时,识别和检测蛋白质以及认识其生理功能是非常艰巨的和繁重的工作。

一,液相芯片体系的组成:
液相芯片体系由许多不同的小球体为主要基质构成,每种小球体上固定有不同的探针分子,将这些小球体悬浮于一个液相体系中,就构成了一个液相蛋白质芯片系统,利用这个系统,我们可以对同一个样品中的多个不同的分子同时进行检测,这种检测技术我们称之为xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling) 技术。
在液相系统中,为了区分不同的探针,每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号。在球形基质的制造过程当中,掺入了两种不同的红色分类荧光,根据这两种红色分类荧光的比例不同,可以把球形基质分为100种。利用这100种球形基质,可以标记上100种不同的探针分子,同时对一个样本中的100种不同的目的分子进行检测。
为了便于探针分子的固定,在球形基质的表面进行了一系列的修饰,可适合各种蛋白,肽,核酸等生物分子的固定
球形基质,探针分子,被检测物,报告分子是液相蛋白芯片的4个主要构成部分。

二,液相芯片体系的反应步骤:
1) 探针分子的固定,
2) 将这种标记好探针的球形基质与样品反应。探针可以与相应的目的分子特异性的结合,带有绿色报告荧光的报告分子也与目的分子特异性的结合,对反应进行定量。
3) 反应结果的检测

蛋白芯片 - 抗体芯片

蛋白组学研究是即基因组学研究后的生命科学发展的一个大方向之一。蛋白质的结构和功能最终直接影响着生命活动的变化,基因转录水平的研究只能在一定程度上反映基因表达产物的变化,而真正发挥功能的蛋白要经过转录后加工、翻译调控以及翻译后加工等许多步骤和调控才能形成,因而对蛋白质的直接研究才能真实的解释各种生命现象。但是目前研究蛋白质的手段和方法还没有很大的发展,所以寻找有效、快捷的蛋白分析技术成为了至关重要的一个环节。

 蛋白芯片技术的出现给蛋白组学研究带来新思路。蛋白组学研究中一个主要的内容就是要研究在不同生理状态或病理状态下蛋白水平的量变,微型化,集成化,高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具,它也是蛋白芯片中发展最快的芯片,而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展,比如肿瘤标志物抗体芯片等,还有很多已经用在研究的各个领域里。

第一张商品化的抗体芯片是由美国BD Clontech公司推出的。这是一张用于研究的抗体芯片,芯片上排列了378种已知蛋白的单抗(Ab Microarray 380, 目录号 K1847-1),这些单抗对应的蛋白都是细胞结构和功能上十分重要的蛋白,涉及信号传导、肿瘤、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡和神经生物学等广泛的领域。通过这张芯片,我们在一次实验中就能够比较几百种蛋白的表达变化。

Ab Microarray 380上抗体是经过精心挑选的,这些抗体不仅可以识别人源的蛋白,对小鼠和大鼠样品同样有效。另外,每个抗体的结合亲和力都经过了实验测定,从多种抗体来源的克隆中筛选出反应特异性好,交叉反应程度小,信号明显的抗体,并且还要保证信号与抗原浓度有着良好的线性关系。优化的抗体探针才可以保证反应的特异和灵敏(可检测20pg/ml的抗原浓度)。芯片的检测是用荧光报告分子,常用的荧光扫描仪都能够完成。

 第一代的蛋白芯片和DNA芯片一样是作为一种定性分析的工具,可用于分析样品之间相关蛋白的相对表达丰度;还可以作为DNA芯片的补充,用于研究蛋白和基因表达之间的关系。   

蛋白芯片 - 操作流程

Ab Microarray 380抗体芯片并不要求特殊的实验操作,只要一般常规的操作就可以完成以往极为复杂耗时的工作。整个操作流程包括:从50—200mg组织或细胞、体液中进行蛋白质抽提——用Cy5和Cy3两种不同颜色的荧光分子分别标记两个样品——洗去多余的标记分子——与芯片杂交孵育——扫描分析结果。整个过程从样品制备到结果分析只要一天即可完成,你只要准备好样品、荧光染料、脱盐纯化柱(处理体液样品时用)和荧光扫描仪,其他的试剂全部由试剂盒提供。

优化的试剂

随芯片试剂盒提供的蛋白抽提/标记缓冲液,是专门为抗体芯片而设计的,非常温和的去垢剂在能高效抽提膜结合蛋白(相比SDS煮沸法能抽提95%以上的蛋白)的同时能保持蛋白的天然活性(非变性条件),这样能够保证抽提的蛋白的溶解性和代表性,保证以后的实验结果的真实性,和原始材料的一致性。

内源标准化信噪比

内源标准化处理可以得到一个内源标准化信噪比(INR),内源标准化处理是指对两个样品(A、B)中分别用两种荧光标记分子(Cy3和Cy5)标记,并交叉与芯片杂交(见图,A-Cy5和B-Cy3一组,A-Cy3和B-Cy5一组分别和芯片杂交),可以作为消除抗原—抗体结合效率差异的对照,也可以消除潜在的不同荧光分子的标记效率差异。假如Cy5标记效率高于Cy3,单纯一个实验的结果就会有偏差(Cy5标记的样品信号偏高),用这种双向交叉反应就可以消除这种偏差。两芯片杂交结果分别得到两组Ratio值,通过免费下载的工具就可以自动算出每个抗体抗原的INR值,这就代表在两个样品间某个蛋白的相对丰度。这种内源标准化处理可以大大减小样品分析的偏差。

抗体芯片检测的结果不是蛋白的绝对含量而是378个目的蛋白在两个样品之间的相对丰度。值得注意的是由于抗体抗原结合的差异、标记差异等原因,根据芯片结果信号的强弱判断同一样品中两种不同蛋白的多少是不恰当的。

蛋白芯片 - 列入医保

 铭源医疗发展公司拥有专利的多肿瘤标志物蛋白芯片检测(简称“C-12蛋白芯片检测”)已作为可报销的临床检测被正式列入《上海市医疗服务项目和价格表》(简称“上海医保目录”)。根据相关规定,上海市基本医疗保险计划受保人可免费或只需支付核准价人民币280元中的28元或56元,便可在医院进行C-12蛋白芯片检测。作为国内最大的城市,上海市的常住人口已超过1880 万,目前约有820 万户籍居民参加基本医疗保险计划,这些居民均有资格部分报销此项临床检测费用。

根据上海市医学会组织专家评审会的一致推荐,上海市卫生局根据卫生部发布的《医疗技术临床应用管理办法》将C-12 蛋白芯片检测归类为“第一类医疗技术”。第一类医疗技术是指“安全性、有效性确切,医疗机构通过常规管理在临床应用中能确保其安全性、有效性的技术”。此次归类将C-12 蛋白芯片检测由传统的健康筛查拓展至针对肿瘤病人的主流临床应用。

自2002年,C-12蛋白芯片面市以来,铭源医疗发展公司已成为蛋白芯片的主要供货商。截止2009年6月底,公司已向中国、马来西亚及泰国的医院累计销售C-12蛋白芯片逾1040万片。此次C-12蛋白芯片检测成功列入上海医保目录将进一步促进其在上海的销售。同时,鉴于上海在长三角的特殊显要位置,此举将为公司继续申请将C-12蛋白芯片检测列入周边其它省市医保目录提供有效的案例研究。公司的C-12蛋白芯片检测为中国医院筛查及监控癌症肿瘤提供了一种具有成本效益并经过临床证实的解决方案。随着预防药物相对传统对症治疗药物的持续增长趋势,相信不远的将来肿瘤标志物市场将继续高速增长。

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